2x Realab Green PCR Fast mixture通用型

Taq SYBR® Green qPCR Premix (通用型)

產品貨號：R0202

儲存條件：長期保存請于 -20℃避光保存，Mix 融解后可在 4℃避光條件下穩定存放一個月，盡量避免反復凍融。

2x Realab Green PCR Fast mixture通用型產品簡介

Taq SYBR® Green qPCR Premix 是 SYBR® Green I 嵌合染料法專用qPCR試劑，為2×預混液，包含除引物和DNA樣品以外的所有qPCR組分，可減少操作步驟，縮短加樣時間，降低污染幾率。其核心組分是經抗體修飾的熱啟動Taq DNA聚合酶，配合精心優化的Buffer體系以及PCR反應促進因子，使產品具有特異性強、擴增效率高等特點，有效抑制非特異性擴增，可對寬廣濃度范圍的模板進行準確定量，獲得穩定可靠的qPCR結果。

2x Realab Green PCR Fast mixture通用型使用方法：

1.適配機型

全機型通用

2.使用注意

① 因Mix中預混有染料，其保存或反應體系配制過程應避免強光照射；

② 使用前上下顛倒輕輕混勻Mix，請勿渦旋振蕩混勻，避免產生過多氣泡。

3.建議的qPCR反應體系

a.調通推薦的引物終濃度為0.2uM，反應效果不佳時可在0.1~1uM范圍內進行調整;

b.推過薦模板加樣量的為1~2ul，如模板類型為未稀釋cDNA原液，模板添加量不應超過總反應體系的10%，不同種類DNA模板中含有的靶基因拷貝數目不同，必要時可進行梯度稀釋，以確定必要的DNA模板添加量。

4.qPCR 反應程序（可根據機型適當調整）

兩步法：

三步法：

a.根據引物的Tm值進行退火&延伸（退火）溫度的設定；若擴增片段在200bp以內，退火&延伸（延伸）時間可以設置為15sec;此外，退火&延伸（延伸）時間的設置還需根據您使用的qPCR儀所需的最短數據采集時間自行調整；

b.不同 qPCR 儀的熔解曲線采集程序有差別，一般可使用儀器默認的熔解曲線采集程序。

5.實驗優化

若使用默認反應條件反應性能不佳時，則需要進行反應條件的優化，可以從引物濃度以及擴增程序兩個方面進行：

① 引物濃度調整

當引物終濃度在0.1~1.0uM范圍之間變化時，引物濃度越低，擴增特異性越高，但擴增效率會有所下降。

② 擴增程序優化

需提高擴增特異性，可使用兩步法程序或提高退火溫度；需提高擴增效率，可使用三步法程序或延長延伸時間。

6.引物設計原則

① 擴增產物長度建議控制在80~200bp；

② 引物長度為18~25bp；

③ 正向引物和反向引物的Tm值相差不超過 1℃為佳，Tm值控制在58~62℃為佳；

④ 引物的GC含量控制在 40%~60% 之間；

⑤ 引物A、G、C、T整體分布盡量要均勻，避開T/C或者A/G的連續結構（特別是3'端）；

⑥ 引物3'端zuihou一個堿基zuihao為G或者C；

⑦ 避開引物內部或者兩條引物之間的互補序列；

⑧ 使用NCBI BLAST功能檢索確認引物的特異性。