類器官與自體免疫細胞共培養，評估靶向mesothelin的納米疫苗

一）《Advanced Human Immune Cell‐Organoid Co-Cultures for Functional Testing of Cancer Nanovaccines》的研究發表于 Advanced Science（2025），由德國、荷蘭、西班牙多家機構聯合完成。文章構建了一個基于人源胰腺癌類器官（PDAC PDO）與自體免疫細胞共培養的體外平臺，用于評估靶向mesothelin（MSLN）的納米疫苗（Mesovac）單獨或聯合化療（FOLFIRINOX）和免疫治療（Atezolizumab）的療效與機制。

?? 一、研究背景與核心問題

?? 二、技術路線與實驗設計（四步閉環）

?? 三、關鍵實驗細節與數據解讀

1. Mesovac疫苗組成

2. 類器官模型構建（詳見下文附件）

來源：PDAC患者術后組織（HLA-A02:01+）

驗證：

IHC/qPCR確認MSLN表達差異

RNA-seq確認KRAS/TP53/SMAD4突變（典型PDAC特征）

MSLN敲除（shRNA）作為陰性對照

3. T細胞來源與激活

4. 共培養系統

5. 聯合治療效應

?? 四、研究意義與展望

?? 五、總結

本研究構建了一個 基于人源胰腺癌類器官與自體免疫細胞共培養的體外評估平臺 ，證實 MSLN納米疫苗聯合FOLFIRINOX與Atezolizumab 可 特異性激活T細胞、清除癌干細胞與耐藥細胞 ，為 胰腺癌個性化免疫治療 提供了 可替代動物模型的臨床前驗證系統 。

（二）附：原文中類器官模型構建

一、組織獲取與倫理

1. 來源：

2. 接受切除術的 PDAC 患者，術中取腫瘤主體部位（tumor bulk）。

3. 所有樣本均來自德國哥廷根大學醫學中心“Molecular Pancreas Program (MolPAC)"隊列。

4. 倫理批件：

5. 本地監管機構批準號：11/5/17、22/8/21ü、2/4/19。

6. 患者簽署書面知情同意，符合《赫爾辛基宣言》。

二、PDO 建立（2D→3D 轉換）

1. 清洗與切碎：

2. 新鮮組織立即置于預冷 PBS中，4 °C 運輸；用無菌剪刀將腫瘤剪成< 1 mm3碎塊。

3. 酶消化：

4. 加入5 mg/mL Collagenase IV + 0.1 mg/mL DNase I（Gibco），37 °C 搖床 30–45 min；每 10 min 用 1 mL 槍頭吹打 10 次，直至無明顯大塊。

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1. 過濾與離心：

2. 70 µm 細胞篩過濾；300 × g，4 °C，5 min 離心；紅細胞裂解（ACK 緩沖液，2 min）→ 再次離心。

3. 基質膠包埋：

4. 細胞沉淀重懸于冰上預冷的 Matrigel（Corning，#356231）；密度：1 × 10? 細胞 / 15 µL Matrigel；點膠于 24 孔板底部，每孔 3–4 滴，形成“dome"；37 °C 固化 15 min。

5. 培養體系（HOGM 培養基）：

6. 
   

1. 傳代：

2.  每 7–10 天用冷 PBS吹打 dome，離心回收； 1:3–1:6 分傳，第 3–5 代用于后續實驗，確保形態與突變譜穩定。

三、質控與表征

1. 形態學：

2.  明場顯微鏡每日觀察，典型囊性/葡萄樣結構為健康標志；出現實心或黑色核心>30 % 即丟棄。

3. 組織病理復現：

4. 4 % PFA 固定→石蠟包埋→HE & IHC（CK19、MUC1、MSLN）確認與原發瘤一致。

5. 基因型：

6. RNA-seq 檢測KRAS G12D/V、TP53、SMAD4等驅動突變；短串聯重復（STR）鑒定與患者組織100 % 匹配。

7. MSLN 表達分層：

8. qPCR：ΔCT 法，內參 β-actin；

9. 流式：anti-MSLN-PE（Santa Cruz sc-33672）；

10. 根據中位值將 PDO 分為MSLN-high與MSLN-low兩組，用于后續殺傷實驗。

四、MSLN 敲除 PDO（陰性對照）

1. shRNA 載體：

2. Target sequence: 5′-GCTGACCTTACAGTGAATA-3′（MSLN 3’UTR）；

3. 載體：pLKO.1-puro-mCherry（VB240722-1232ymd，VectorBuilder）。

4. 感染流程：

5. 單細胞懸液 + 病毒（MOI = 500）+ 10 µg/mL Polybrene；離心感染（800 × g，45 min，32 °C）；24 h 后換液，72 h 加 2 µg/mL puromycin 篩選 7 天；

6. 流式分選 mCherry? 群體，敲降效率>80 %（qPCR & WB 驗證）。

五、冷凍與復蘇

凍存液：90 % FBS + 10 % DMSO，1 °C/min梯度降溫至 –80 °C，次日轉液氮。

復蘇：37 °C 水浴快速融化→冷 PBS 稀釋 10 倍→離心→重懸于 Matrigel，存活率>90 %。

六、關鍵注意事項

1. Matrigel 必須全程冰上，任何升溫均會導致提前聚合。

2. Wnt3a/RSPO1 條件培養基需新鮮收集（< 2 周），活性下降會直接導致 PDO 生長停滯。

3. Y-27632 僅前 3 天使用，長期存在會改變類器官基因表達譜。

4. 每批次 PDO 需重新檢測 MSLN 表達，因隨傳代可能出現表達漂移。

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