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酶標儀長時間動力學讀板模式助力微生物生長監測
動力學讀板模式是酶標儀除終點法之外最常用的檢測模式，用于測量樣品在一段時間內發生的變化，長期動力學測量可用于研究生物學的眾多方面，如酶動力學、細胞信號傳導和蛋白質表達。
然而，在酶標儀上運行這樣一個長期連續動態讀取的實驗需要占用酶標儀很長一段時間，大大降低了儀器的使用效率。此外，進行一系列終點法讀取會產生一個一個的單獨數據，必須手動將它們連接在一起才能生成動力學曲線圖。使用 Molecular Devices 公司的酶標儀和 SoftMax Pro 軟件，研究人員現在可以使用軟件的中斷和繼續讀板功能進行長時間測量 (圖 1) 。這些功能允許從儀器中移除微孔板進行培養基添加或其他實驗，然后恢復動力學讀數，同時將所有數據點保留在單個孔板中，以便于分析。
圖 1：非連續動力學測量。動態測量可以通過按下中斷按鈕。要繼續收集同一數據文件內的動力學測量值，可按下恢復 (Append) 按鈕
這里向大家介紹如何使用非連續動態讀取方式通過 600 nm 的吸光度進行 24 小時細菌生長測量。在時間零點啟動了動力學讀板。要中斷動力學測量，在 SoftMax Pro 軟件的“控制與狀態"區域點擊“中斷"按鈕。儀器在暫停前完成了所選讀取區域中剩余孔的讀取。然后將板從酶標儀中取出。對于動力學讀取的下一個時間點，將孔板放入酶標儀。打開原始數據文件，點擊繼續 (Append) 按鈕以恢復動力學讀取并添加更多數據點 (表 1) 。
表 1：酶標儀設置用于細菌生長曲線的數據采集
繼續 (Append) 功能將不連續的測量結果連接成一個連續的細菌生長曲線。在 SoftMax Pro 軟件中計算細菌生長曲線的開始時間，比較細菌生長條件。設置數據歸一化，計算細菌培養達到 0.6 OD 值所需的起始時間，并計算細菌生長曲線拐點處的斜率 (表 2) 。
表 2：細菌生長的不同參數。SoftMax Pro 軟件可用于分析細菌生長的不同階段。軟件可計算出細菌生長到達 0.6 OD 值所用時間
細菌培養會經歷四個階段：延滯期、對數期、穩定期和衰退期 (圖 2) 。本實驗采集了足夠多的數據點，以生成三種不同細菌培養物的細菌生長曲線 (圖 3) 。數據顯示，每種培養物在不同時間依次經歷延滯期、對數期和穩定期。圖中未觀察到衰退期，因為儀器所采用的光散射法測量的是樣本的質量而非單個細胞。死亡細胞仍占據樣本的質量，并對光散射產生影響，從而影響 OD 600 值。
圖 2：細菌生長階段。細菌生長的四個不同階段
圖 3：細菌生長曲線。使用酶標儀和 SoftMax Pro 軟件對三種不同稀釋度的細菌進行了測量。測量時長為 24 小時。可以看出，即便數據點之間的時間間隔較大，軟件仍能將它們連接起來
利用 SoftMax Pro 軟件可以計算細胞生長的各種參數。通過計算細菌培養物達到特定光密度時的時間，可以對生長速率進行定量比較。在本實驗中，可以觀察到在 10 倍稀釋的培養物中所需時間最短 (表 2) 。
檢測細菌生長曲線的另一個用途是開發和優化檢測方法來篩選抗菌化合物，這是許多微生物和藥物開發實驗室感興趣的方向。使用 SoftMax Pro 軟件中的工作流編輯器 (Workflow Editor) 功能記錄細胞密度和轉染的 GFP 信號隨時間變化的過程，并進行各種數據轉換，例如將 GFP 信號歸一化為細胞密度，以及提取生長速率或其他動力學相關信息。
本實驗使用含有質粒 pMV158-GFP 的糞腸球菌菌株 OG1RF 在不同的生長條件下進行研究。利用 SoftMax Pro 工作流程編輯器 (Workflow Editor) ，創建了一個包含吸光度讀數（OD600）和熒光讀數（GFP）的動態循環，并在兩次讀數之間進行 5 秒的孔板線性震蕩 (圖 4) 。在 600 nm 處測量吸光度（OD600），以確定細菌的生長情況。通過底部讀取熒光檢測來監測 GFP 表達，作為存活情況的指標，激發波長為 485 nm，發射波長為 515 nm。兩條數據軌跡 (吸光度和熒光) 記錄在兩個獨立的孔板區域中。該動態循環被設置為每 15 分鐘重復一次，總共持續 18 小時。可選的軟件功能允許用戶暫停和恢復動態讀取，從而在運行過程中添加試劑。所得的雙重讀取模式動態數據使用 SoftMax Pro 軟件進行分析。
圖 4：SoftMax Pro 7 工作流編輯器雙讀取模式動態檢測。拖放功能易于創建，并且可以快速設置自定義工作流
通過運算設置界面可以進行高級動態學數據分析。圖 5 展示了細菌生長實驗的運算方法設置。菜單被分為兩個部分：原始數據和數據運算步驟。
圖 5：運算設置菜單中的數據分析選項。此圖展示了對孔板截面 OD600nm 的光密度數據進行對數變換，然后用 5 個 Vmax 點將其還原為 Vmax 速率值，以檢索曲線最陡的部分
原始數據跟蹤與轉換 (標準化) 數據跟蹤的比較視圖如圖6所示。
圖 6：GFP 信號歸一化到 OD600 的細胞密度
當然，也可以將原始數據進行對數轉換，并計算出最大生長速率，如圖 7。
圖 7：原始和運算后的數據視圖，對 OD600 數據應用對數運算。以 A1 ~ A5 孔為例，分別進行不同的實驗條件。上圖：OD600 動力學數據軌跡的原始數據 (藍線) 。下圖：使用對數縮放 (黑線) 轉換的原始數據，以及通過應用 Vmax 數據運算 (橙線) 確定指數階段的增長率
為了讓用戶能夠以表格形式直觀地比較不同的生長條件 (以數值形式呈現) ，模板編輯工具允許將板布局與樣本組進行關聯，然后將運算后的數據 (最大增長率) 以表格形式展示出來，如圖 8 (上圖) 所示。通過后續的計算步驟，可以得到生長速率 (k) 和倍增時間 (g) 。為了更好地進行數據可視化，結果可以以柱狀圖的形式展示 (圖 8，下圖) ，以便更輕松地評估生長條件或處理效果。
圖 8：結果顯示選項。將糞腸桿菌運算數據顯示及各實驗條件下的結果 (第 1 列至第 5 列，n=8) 匯總在結果表中，并以柱狀圖表示。使用 Vmax 速率展示生長速率 (k=Vmax*3600) 和倍增時間 (g=ln2/k)
綜上所述，在以 SpectraMax iD3s 為代表的多功能酶標儀上，利用非連續動力學檢測模式和 SoftMax Pro 軟件的工作流編輯器 (Workflow Editor) 以及強大的數據計算能力，可以靈活地設計微生物動態監測過程，包括中途添加試劑或藥物，兩種或多種檢測功能按次序自動運行，無需借助第三方軟件進行數據處理和曲線圖形繪制，幫助我們高效完成微生物相關研究。
SpectraMax iD3s 多功能微孔板讀板機
關于美谷分子儀器
Molecular Devices 始創于上世紀 80 年代美國硅谷，并在全球設有多個代表處和子公司。2005 年，Molecular Devices 在上海設立了中國代表處，2010 年加入全球科學與技術的創新者丹納赫集團，2011 年正式成立商務公司：美谷分子儀器 (上海) 有限公司。Molecular Devices 以持續創新、快速高效、高性能的產品及完善的售后服務著稱業內，我們一直致力于為客戶提供在生命科學研究、制藥及生物治療開發等領域蛋白和細胞生物學的創新性生物分析解決方案。
